Ферменты липоксигеназного каскада: структурная характеристика, каталитические свойства, молекулярная эволюция тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.05, доктор биологических наук Гоголев, Юрий Викторович

Оглавление диссертации доктор биологических наук Гоголев, Юрий Викторович

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Оксилипины как биологически активные соединения.

1.2. Метаболизм оксилипинов.

1.3. Общая характеристика липоксигеназ.

1.4. Специфичность действия липоксигеназ.

1.5. Модели специфичности действия липоксигеназ.

1.6. Третичная структура липоксигеназ.

1.7. Липоксигеназа-3 кукурузы (ZmLOX3).

1.8. Общая характеристика ферментов Р450.

1.9. Общая характеристика ферментов семейства CYP74.

1.10. Структурная организация ферментов семейства CYP74.

1.15. Сравнение механизмов катализа цитохромов CYP и монооксигеназ Р450.

1.16. Локализация ферментов CYP74.

1.17. Регуляция экспрессии генов ферментов липоксигеназного каскада.

1.18. Молекулярная эволюция ферментов липоксигеназного каскада.

1.18.1. Общие представления о молекулярной эволюции.

1.18.2. Классификация и молекулярная филогения липоксигеназ.

1.18.3. Классификация цитохромов семейства CYP74.

1.18.4. Ферменты семейства CYP74 вне царства растений.

1.18.5. Молекулярная филогения ферментов CYP74.

1.19. Постановка цели исследования.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Методы биоинформатики.

2.2. Подготовка растительного материала.

2.3. Выделение тотальной РНК из листьев растений.

2.4. Реакция обратной транскрипции и получение двуцепочечной кДНК.

2.5. Полимеразная цепная реакция.

2.6. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в агарозном геле.

2.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.8. Молекулярное клонирование ДНК.

2.8.1. Характеристика бактериальных штаммов.

2.8.2. Среды для культивирования бактерий.

2.8.3. Приготовление компетентных клеток Е. coli.

2.8.4. Перенос плазмид в компетентные клетки Е. coli.

2.8.5. Клонирование ПЦР-фрагментов.

2.8.6. Клонирование полноразмерных кДНК.

2.8.7. Клонирование целевых генов в экспрессирующие векторы.

2.9. Сайт-направленный мутагенез клонированных генов.

2.10. Наработка и очистка рекомбинантных белков.

2.10.1. Выращивание культур продуцентов и индукция синтеза рекомбинантных белков.

2.10.2. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле.

2.10.3. Выделение и очистка рекомбинантных белков.

2.11. Реактивы и материалы для исследований катализа рекомбинантных ферментов.

2.12. Получение препаратов из растительного материала и подготовка субстратов.

2.12.1. Получение препаратов ацетонового порошка семян.

2.12.2. Получение препаратов свободных жирных кислот.

2.12.3. Получение препаратов гидроперекисей жирных кислот.

2.13. Кинетические исследования реакций липоксигеназного каскада.

2.14. Анализ продуктов реакций липоксигеназного каскада методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2.14.1. Хроматография на обращенной фазе.

2.14.2. Хроматография на нормальной фазе.

2.15. Спектральные исследования.

2.15.1. Подготовка образцов для ГХ-МС.

2.15.2. Проведение экспериментов по ГХ-МС.

2.15.3. Получение спектров оптического поглощения.

2.15.4. Получение ЯМР-спектров.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Получение рекомбинантного фермента 2тЬОХЗ.

3.1.1. Экспрессия 2тЬОХЗ в бактериальном продуценте.

3.1.2. Очистка рекомбинантного фермента 2тЬОХЗ.

3.2. Окисление линолевой и линоленовой кислот при участии гтЬОХЗ и ОтЬОХ1.

3.3. Участие (78)-гидроперекиси 16:3 в липоксигеназном пути.

3.4. Направленная модификация первичной структуры 2тЬОХЗ.

3.4.1. Создание мутантных форм ZmLOXЗ.

3.4.2. Окисление линолевой кислоты мутантными формами гтЬОХЗ.

3.4.3. Окисление сложных липидов 2т1Х)ХЗ и ZmLOXЗAla562Gly.

3.5. Моделирование механизма ферментативного действия 2тЬОХЗ.

3.5.1. Трехмерная модель 2тЬОХЗ.

3.5.2. Модели позиционирования субстратов в активном центре липоксигеназ.

3.6. Клонирование гена алленоксидсинтазы томата LeAOS3.

3.7. Получение очищенного рекомбинантного фермента LeAOS3.

3.8. Продукты превращения 9-гидроперекиси линолевой кислоты при участии LeAOS3.

3.9. Анализ энантиомерного состава цис-10-оксо-11-фитоеновой кислоты.

3.10. Анализ энантиомерного состава а-кетола и метоксикетона.

3.11. Превращение 13-гидроперекиси линолевой кислоты при участии

3.12. Характеристика специфичности действия LeAOS3 (CYP74C) и алленоксидсинтазы кукурузы ZmAOS (CYP74A).

3.13. Превращение окиси аллена LeAOS3 in situ.

3.14. Предполагаемый механизм реакции, катализируемой LeAOS3.

3.15. Исследование доменов LeAOS3 и гидроперксидлиазы люцерны MtHPL методом сайт-направленного мутагенеза.

3.15.1. Определение домена IHCD в первичной структуре ферментов CYP74.

3.15.2. Выбор позиций и аминокислотных замен в полипептидной цепи LeAOS3.

3.15.3. Анализ продуктов катализа мутантных форм LeAOS3.

3.15.4. Выбор сайтов и аминокислотных замен в полипептидной цепи MtHPL.

3.15.5. Сравнительный анализ результатов сайт-направленного мутагенеза LeAOS3 и MtHPL.

3.16. Обнаружение новых генов ферментов CYP74 льна-долгунца.

3.17. Выявление и клонирование кДНК CYP74B16.

3.18. Получение препарата рекомбинантного белка CYP74B16.

3.19. Идентификация фермента CYP74B16.

3.20. Исследование кинетических параметров реакций, катализируемых ЬиБЕБ.

3.21. Сравнение 1дЮЕ8 с другими членами подсемейства СУР74В.

3.22. Направленная модификация первичной структуры ЬиОЕБ.

3.23. Каталитические свойства ЬиБЕ8 Е292С.

3.24. Филогенетический анализ и классификация ферментов липоксигеназного каскада.

3.24.1. Филогенетический анализ липоксигеназ.

3.24.2. Филогенетический анализ цитохромов СУР74.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Физиология и биохимия растений», 03.01.05 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Ферменты липоксигеназного каскада: структурная характеристика, каталитические свойства, молекулярная эволюция»

Постановка проблемы и ее актуальность.

Липоксигеназный каскад является источником физиологически активных соединений - оксилипинов. У высших растений оксилипины отвечают за регуляцию роста, дифференциацию клеток, морфогенез, а также участвуют в индукции органогенеза и формировании системной устойчивости к различным экстремальным факторам и патогенам [Тарчевский, 2001, ПоЬ е? а1., 2002; БШшре, РешБпег, 2006]. Кроме высших растений оксилипины и ферменты их биосинтеза обнаружены у некоторых бактерий, бурых водорослей, красных водорослей, а также у представителей кораллов, хордовых и пластинчатых (ТпсИор1ах асИгаегет) [Ьее е/ а1, 2008].

Ключевыми ферментами липоксигеназного каскада, обеспечивающими разнообразие продуктов, являются липоксигеназы и ферменты уникального семейства СУР74 суперсемейства Р450. Липоксигеназы животных, водорослей, грибов и микроорганизмов используют в качестве субстратов Сго-жирные кислоты (например, арахидоновую кислоту), в то время как липоксигеназы растений в основном катализируют превращение С^-жирных кислот (линолевой и а-линоленовой кислоты). У многих видов растений, животных и микроорганизмов определены нуклеотидные последовательности генов липоксигеназ. Однако лишь некоторые из них клонированы с целью исследования функциональных белковых продуктов. Продукты первичной липоксигеназной реакции - гидроперекиси жирных кислот - преобразуются ферментами СУР74: алленоксидсинтазами (АОС), гидропероксидлиазами (ГПЛ), дивинилэфирсинтазами (ДЭС). Исследования последних лет показали, что большинство ферментов СУР74 являются дегидразами (АОС и ДЭС) и изомеразами (ГПЛ). В то же время, большое разнообразие неизученных генов СУР74 в геномах различных организмов свидетельствует о вероятности существования других типов катализа. К настоящему времени охарактеризовано несколько десятков ГПЛ и АОС, в то время как клонировано лишь 5 генов ДЭС разных видов растений, принадлежащих двум родам. Существует мнение, что ферменты этого класса не имеют широкого распространения в природе. Тем не менее, круг организмов, обладающих дивиниловыми эфирами, неуклонно расширяется.

Интерес к оксилипинам обусловлен высокой практической значимостью веществ этого класса. Они являются сигнальными соединениями, обеспечивающими защитный ответ растений на клеточном, организменном, популяционном и межвидовом уровне, что может быть использовано в современном агропромышленном производстве. Оксилипины ответственны за многие свойства растений, характеризующие их в качестве сырья и пищевых продуктов. В настоящее время некоторые рекомбинантные ферменты липоксигеназного каскада нашли свое применение в биотехнологии для производства компонентов в парфимерной и пищевой промышленности. В этой связи изучение первичных детерминантов катализа ферментов липоксигеназного каскада, исследование молекулярной эволюции и систематики, разработка моделей катализа представляются актуальными.

Объем экспериментальных и теоретических данных, накопленный в разных лабораториях мира, позволил во многом выяснить критические параметры первичной и третичной структур активных центров ферментов. Существенно расширено представление о механизмах ферментативного катализа. Опираясь на данные рентгеноструктурного анализа, изучения молекулярной структуры и динамики белковых молекул и фермент-субстратных комплексов, во многих случаях удалось создать термодинамические модели протекания ферментативных реакций. В то же время, ферментативный катализ липоксигеназ и ферментов СУР74 остается недостаточно охарактеризованным.

В зависимости от региоизомеров продуктов реакции липоксигеназы растений разделяются на (95)- и (13£)-специфичные. Предложенные модели взаимодействия активного центра некоторых липоксигеназ с различными жирными кислотами объясняют каталитические свойства 13-липоксигеназ, однако не согласуются с экспериментальными данными, полученными при изучении 9-липоксигеназ. Несмотря на большое разнообразие оксилипинов, в значительной степени изученными можно считать биосинтез и функции жасмоновой кислоты и ее производных, являющихся продуктами превращения 13-гидроперекисей жирных кислот. В отношении других оксилипинов, в частности, производных 9-гидроперекисей жирных кислот, объем знаний остается недостаточным. Неисследованным остается вопрос об участии в липоксигеназном каскаде растений других ненасыщенных жирных кислот, кроме линолевой и а-линоленовой, в том числе жирных кислот гексадеканового ряда, составляющих до 20 % от общего количества липидов в 16:3 растениях [Тагшевоп, Яе1(1 1971; Моп§гапё е? а1., 2005].

Особый интерес представляет молекулярная эволюция ферментов липоксигеназного каскада. Широкое распространение липоксигеназ предусматривает их первичное возникновение по отношению к цитохромам. Однако отсутствие какой-либо функциональной значимости гидроперекисей жирных кислот ставит вопрос о возможном включении липоксигеназ в существовавший ранее метаболический процесс с другим источником данного субстрата, в том числе неферментативного окисления ненасыщенных жирных кислот.

Филогения и систематика ферментов СУР74 остается на стадии разработки. Использование стандартных алгоритмов классификации для данного семейства приводит к объединению в систематические группы функционально не связанных ферментов. С другой стороны, некоторые ферменты - типичные представители СУР74 по биохимическим характеристикам - не удовлетворяют молекулярным критериям принадлежности к семейству, в связи с чем предложено включить эти ферменты в одноименный «клан». При этом данный клан рассматривается как продукт поздней эволюции растений, появление которого было связано с выходом растений на сушу. Однако недавние открытия липоксигеназного каскада у широкого круга организмов, включающего животных, бурых водорослей и прокариот, свидетельствуют о древнем происхождении этого ферментативного пути и его фундаментальном физиологическом значении на ранних этапах развития жизни.

Обнаруживаемые противоречия могут быть следствием малой изученности ферментов СУР74. Так, у классического объекта - льна-долгунца (Ыпит тиайььтит Ь.), с которого началось изучение ферментов данного семейства, недавно были выявлены новые оксилипины - необычные изомеры дивиниловых эфиров и их производные - линолипины. Было показано, что инкубация линолевой и а-линоленовой кислот, либо их 13-гидроперекисей, с экстрактом листьев льна приводит к образованию (9Д, 11 102)-12-( 10-гексенилокси)-9,11-додекадиеновой, либо (92,1 \Е, 102, 302)-12-( 10,30-гексадиенилокси)-9,11-додекадиеновой кислот, соответственно, в качестве основных продуктов [СЬесЬе1кт а. 2008]. Однако попытки выделения из корней и побегов этого растения фермента, ответственного за синтез дивиниловых эфиров, оказывались безрезультатными. На повестке дня стоит вопрос о поиске гена кодирующего данный фермент и получение последнего в виде рекомбинантного белка.

Выяснение эволюционных процессов, обусловливающих возникновение сложных реакционных комплексов, является одним из фундаментальных вопросов эволюции живых систем. С точки зрения молекулярной филогении ферменты липоксигеназного каскада представляют удобную модель, которая позволяет проследить коэволюцию двух типов ферментов, осуществляющих цепь сопряженных реакций. Детерминированность липоксигеназного каскада в относительно небольшом количестве направлений биосинтеза оксилипинов при одновременной пластичности ферментов, способных к конверсии при минорных модификациях первичной структуры, дает возможность экспериментальной реконструкции эволюционных процессов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является выяснение механизмов каталитического действия ферментов липоксигеназного каскада и построение филогенетической модели, описывающей эволюционное развитие этих механизмов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Структурно-функциональная характеристика рекомбинантной липоксигеназы ZmLOX3 кукурузы