Молекулярная модификация бетулиновой кислоты как антимеланомного средства и подходы к ее солюбилизации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова.
доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович
доктор химических наук, профессор Звонкова Елена Николаевна кандидат химических наук,
старший научный сотрудник Водовозова Елена Львовна
биоорганической химии (ТИБОХ) РАН
Защита диссертации состоится 27 декабря 2004 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу 119831, Москва, ул. М. Пироговская, д.1.
Учёный секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Рост заболеваемости меланомой в России с 1992 по 1999 гг. составил 30%, уступая лишь раку щитовидной и предстательной желез. Следует отметить, что среди всех злокачественных опухолей кожи меланома занимает особое место. Так, составляя структурно не более 10% от всех форм рака кожи, она ответственна за 80% смертей, приходящихся на группу злокачественных опухолей кожи. На ранней стадии заболевания эффективно хирургическое лечение, но прогноз при метастатической меланоме остается очень плохим. Средняя продолжительность жизни пациентов с метастазами составляет один год.
В настоящее время для лечения пациентов с метастатической меланомой широко применяются такие препараты, как дакарбазин, цисплатин, производные нитрозомочевины (кармустин, ломустин, семустин), интерферон-а, интерлейкин-2. При монохимиотерапии активность препаратов не превышает 20%. В случае комбинированной терапии эффективность лечения достигает 30-50%. Следует отметить, что главной причиной неэффективности лечения является высокая токсичность препаратов.
Бетулиновая кислота (ЗР-гидроксилуп-20(29)-еновая кислота, (БК*))
В середине 90 годов прошлого столетия было обнаружено, что БК способна селективно ингибировать рост клеток меланомы человека и ряда других опухолей
* Сокращения: БК - бетулиновая кислота; ДМФХ - димиристоилфосфатидилхолин; лизоФХ - лизофосфатидилхолин; ПАВ - поверхностно-активное вещество; СА -стеариламин; ТЭБА - триэтилбензиламмоний хлорид; Хол - холестерин; яФХ -яичный фосфатидилхолин; 1С50 - концентрация исследуемого препарата, вызывающая 50% гибель клеток в культуре; Ка-ОК - натровая соль олеиновой кислоты; ТМЭК -триметисиланазид. _______
нейроэктодермального происхождения путем включения механизма апоптоза. В отличие от большинства современных препаратов применяемых для лечения метастатической меланомы, БК не токсична для организма (вплоть до 500 мг/кг). Одной из основных проблем при лечении злокачественных образований является развитие резистентности опухолей к применяемым препаратам. Поэтому уникальное свойство БК ингибировать рост опухолевых клеток, устойчивых к таким препаратам как доксорубицин, открывает новые перспективы для преодоления этой проблемы. Помимо противоопухолевых свойств, БК и ее производные обладают довольно широким спектром активностей: анти-ВИЧ, противовоспалительной, антималярийной, антиангиогенной и др.
БК можно рассматривать как новое родоначальное соединение (lead compound) с аптимеланомной активностью. Однако использовать ее в качестве препарата для лечения метастатической меланомы в настоящее время не представляется возможным. Одним из основных факторов, ограничивающим использование БК, является довольно большая терапевтическая доза (
250 мг/кг). Весь опыт химии лекарственных веществ говорит о том, что родоначальное соединение очень редко обладает оптимальными терапевтическими характеристиками. Поэтому актуальной задачей является проведение исследований по выявлению взаимосвязи структура-активность (SAR), и на основании полученных данных синтез новых более эффективных производных БК.
Плохая растворимость в воде (по нашим данным
1 мкг/мл) также ограничивает использование БК в качестве антимеланомного препарата. Одним из подходов для преодоления этой проблемы может стать включение БК в состав наночастиц: липосом или нанокристаллов. Такие частицы по сравнению с водорастворимыми формами лекарств обладают рядом преимуществ. Во-первых, липосомы и нанокристаллы не токсичны для организма, они защищают включенные в их состав лабильные вещества от биодеградации. Из-за своих малых размеров они могут быть введены в организм внутривенно и не вызывать эмболию, а, благодаря эффекту пассивного нацеливания, они имеют тенденцию накапливаться в опухолях, и при определенных условиях поглощаться клетками, а это, в свою очередь, приводит к желательному повышению концентрации лекарственного вещества в солидных опухолях и очагах воспаления. Все вышесказанное делает очень привлекательным
использование наночастиц в качестве носителя для конструирования новых лекарственных форм БК.
Работа выполнена кафедре биотехнологии МГАТХТ в рамках госбюджетной темы НИР 1.5.00 «Синтез новых фармакологически активных веществ и изучение их биологических свойств и методов направленного транспорта с целью создания противоопухолевых, противовирусных, антипаркинсонических средств» и при поддержке грантов РФФИ (00-04-48363), РФФИ MAC (02-04-07604), МНТЦ (1781).
1. Синтез новых аналогов БК.
2. Разработка методов солюбилизации БК и ее аналогов.
3. Исследования биологической активности БК и ее аналогов.
Научная новизна работы. Предложены и осуществлены новые модификации БК. Синтезирована эпи-бетулиновая кислота стереоселективным восстановлением 3-кетогруппы бетулоновой кислоты. Используя метод Макоши, получены новые циклопропановые производные бетулоновой и бетулиновой кислот. Осуществлена схема синтеза новых сульфамидных производных (28-тозиламинолупсола, 28-мезиламинолупеола). В условиях микроволнового облучения получено новое тетразольное производное (28-дезметил-28-(5-тетразолил)лупеол).
Обнаружено, что реакции замещения у атомов, соседствующих с четвертичными атомами углерода (СЗ и С28) в ряду лупанового ряда осложняются побочными процессами: при замещении гидроксила на бензоилоксигруппу и тозилокси- на формилоксигруппу при СЗ образуются продукты -элиминирования; реакции замещения гидроксильной группы при С28 в производных бетулина осложняются перегруппировкой, приводящей к расширению циклопентанового кольца с последующим элиминированием.
Изучена эффективность включения бетулиновой кислоты и ее производных в липосомы. БК из образцов с большим содержанием активного вещества включается в липосомы хуже. Для 95% БК максимум включения в липосомы составляет 16.5 мол.% при использовании композиции для 99% БК, а также ее
производных - менее 2 мол.%.
Изучено образование наносуспензий БК, стабилизированных
Выявлена цитотоксическая активность эпи-бетулиновой кислоты по отношению к линии клеток меланомы Вго, которые не чувствительна: к БК. Из циклопропановых производных БК наиболее активными по отношению к линиям клеток меланомы Вго и карциномы яичника СаОу являются 20,29-дищдро-20,29-дихлорметилен-и 20,29-дигидро-20,29-дибромметиленбетулиновые кислоты. К линии клеток меланомы Со1о38 проявила активность, сравнимую с БК, только 20,29-дигидро-20,29-дихлорметиленбетулиновая кислота
Показана перспективность молекулярных модификаций в области изопропенильной группы и при СЗ.
Практическая значимость работы. Эпи-бетулиновая кислота, а также дихлор- и дибромциклопропановые производные БК проявили цитотоксическую активность по отношению к линии клеток меланомы Вго, которые не чувствительны к БК. Таким образом, полученные соединения могут явиться основой для разработки новых препаратов лупанового ряда против меланомы Вго.
Изучено образование наносуспензий БК, стабилизированных яФХ. Достоинством данной лекарственной формы является то, что, во-первых, нанокристаллы БК имеют размеры меньше 500 им и, следовательно, могут быть введены в кровоток, не вызывая эмболию. Во-вторых, такая форма является эффективной с точки зрения соотношения лекарственное вещество/носитель. И, наконец, при образовании нанокристаллов «растворимость» БК в воде увеличилась в 1500 раз.
Положения выносимые на защиту.
1. Синтез новых аналогов БК: эпи-бетулиновой кислоты; циклопропановых производных бетулиновой и бетулоновой кислот; сульфамидных производных (28-тозиламинолупеола, 28-мсзиламинолупеола); тетразольного производного (28-дезметил-28-(5-тетразолил)лупеола).
2. Элиминирование и перегруппировки при СЗ и С28 в ряду лупановых производных.
3. Солюбилизация БК с помощью липосом и нанодисперсий.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и тезисы 7 докладов на научных конференциях, одна статья принята к печати.
Апробация работы. Результаты работы доложены на: The 25th International Symposium on Controlled Release of Bioactive Materials" (Las Vegas, USA, June 1998), Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ-2002 (Москва 4-7 июля 2002), I Международном Конгрессе «Биотехнология-состояние и перспективы развития» (Москва. 14-18 октября 2002), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва. 20-22 Марта 2003). Международной научно-технической конференции «Перспективы развития химии и практического применения алициклических соединений» (Самара. 2004), X Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2004» (Волгоград. 710 сентября 2004).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит рисунков и таблиц. Список литературы включает источников.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На основании анализа данных о взаимосвязи «структура-активность» производных, а также родственных соединений БК были предложены структуры, которые по нашему мнению должны обладать большей активностью:
• Производные БК с увеличенным объемом в области изопропенильной группы, без значительного уменьшения гидрофобности.
• Аналоги БК с биоизостерической заменой карбоксильной группы.
1. СИНТЕЗ НОВЫХ АНАЛОГОВ БЕТУЛИНОВОЙ КИСЛОТЫ
1.1 ЭПИМЕРИЗАЦИЯ ГИДРОКСИЛьНОЙ ГРУППЫ В ТРИТЕРПЕНАХ ЛУПАНОВОГО РЯДА
Ранее в нашей лаборатории было показано, что бетулоновая кислота (7)
обладает в 18 раз большей цитотоксичностью по отношению к клеткам меланомы MS,
чем бетулиновая кислота (10b).
Проведенный нами анализ литературных данных о взаимосвязи «структура-активность» ряда тритерпенов показал, что биологическая активность, как правило, увеличивается при переходе от ЗР-гидрокси- к 3-кетогруппе, а затем к За-гидроксигруппе.
Рис.1. Предполагаемое увеличение активности в ряду лупановых производных
Мы предположили, что и для антимеланомной активности в ряду бетулиновой кислоты эта закономерность также может соблюдаться, то есть эпи-бетулиновая кислота может проявлять большую активность. Для проверки данной гипотезы необходимо было разработать удобный метод получения эпи-бетулиновой кислоты (10а). К настоящему времени известна только одна работа, в которой авторы выделяли эпибетулиновую кислоту (10а) экстракцией из коры кустарника Picramnia pcntandra SW., произрастающего в США, при этом из 0.9 кг коры было выделено 0.8 г эпи-бетулиновой кислоты (10а).
Были исследованы два пути получения эпи-бетулиновой кислоты (10а): 1) эпимеризация соединений Зр-ряда; 2) стереоспецифическое восстановление бстулоновой кислоты (7). Для эпимеризации исследовали две реакции эффективные в случае холестан- -ола: замещение тозилокси- на формилоксигруппу и замещение НО-группы на бензоилоксигруппу по Мицунобу. В нашем случае оба метода привели почти целиком к продуктам А2,3-элиминирования (схема 1; табл. 1). Из З-О-тозиллупеола (3) образовался 3-дезокси-2,3-дегидролупеол (6); из бетулина (1)3-дезокси-2,3-дегидробетулин (4) и бензоат 3-дезокси-2,3-дегидробетулина (5). В 'Н-ЯМР-спектрах соединений наблюдались сигналы протонов дополнительной двойной связи в районе 8 5.39-5.28 м.д. и отсутствовал сигнал протона CHOR1. В спектре же соединения (5) сигналы метиленовых протонов СН2О сдвинулись в более слабое поле на 0.65 и 0.75 м.д. по сравнению с соответствующими сигналами в исходном бетулине (1), что говорит о замещении первичного гидроксила при С28 на бензоилоксигруппу.
(2)К1=Н,Я2=Н (5) Я3=ОВ7.
(3) Я^ТБ, Я2=Н (6) Я3=Н
Схема 1. Бимолекулярное замещение 3(5 гвдроксильной группы в тритерпенах лупанового ряда, приводящее к продуктам Л2,3-эдиминирования
Кольцо А у соединений лупанового ряда, в отличие от веществ холестанового ряда, содержит гем-диметильную группировку при С4. Стерические и электронные эффекты, обусловленные этой структурной особенностью, делают более вероятными реакции элиминирования и препятствуют реакции бимолекулярного замещения. В связи с этим, вероятно, любые варианты бимолекулярного замещения в положении 3 лупанового ряда малоперспективны.
Каталитическое гидрирование бетулоновой кислоты (7) над никелем Ренея приводило к восстановлению лишь двойной связи изопропенильной группы с образованием 20,29-дигидробетулоновой кислоты (8). В 'Н-ЯМР-спектре данного соединения наблюдаются два характерных дублета метальных протонов при СЗО (0.88 м.д.) и С29 (0.76 м.д). В тоже время сигнал от протона при СЗ не появился. При использовании более активного катализатора, 5% Ии/С образовывалась смесь а- И эпимеров 20,29-дигидробетулиновой кислоты (9а, 9Ь) в соотношении. 60:40 (по данным 'Н-ЯМР-спектра) (схема 2; табл. 1). О восстановлении кето-группы бетулоновой кислоты говорит появление в ИК-спектре характерного сигнала ОН-группы (3430 см"1). Кроме того, в 'Н-ЯМР-спектре вещества наблюдались сигналы протонов изопропилыюй группы, и протонов при СЗ, соответствующих а- и