Комплексный анализ системы Toll-подобных рецепторов при различных патологических состояниях человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, доктор медицинских наук Хорева, Марина Викторовна

Оглавление диссертации доктор медицинских наук Хорева, Марина Викторовна

ЧАСТЬ I. Обзор литературы.

ГЛАВА I. Паттерн-распознающие рецепторы врожденного иммунитета.

1.1-. Характеристика паттерн-распознающих рецепторов.

1.2. Характеристика То11-подобных рецепторов.

1.2.1. Строение То11-подобных рецепторов.

1.2.2. Функции То11-подобных рецепторов.

1.2.3.Сигнальные пути То11-подобных рецепторов.

1.2.4.Экзогенные лиганды То11-подобных рецепторов.

1.2.5.Эндогенные лиганды То11-подобных рецепторов.

1.2.6.Эндогенные лиганды в патогенезе заболеваний человека.

1.2.7.Роль То11-подобных рецепторов в развитии патологии.

То11-подобные рецепторы при иммунодефицитных заболеваниях 69 То11-подобные рецепторы в развитии сердечно-сосудистых заболеваний.

То11-подобные рецепторы в развитии острого панкреатита.

ЧАСТЬ II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА II. Материалы и методы исследования.

2.1. Характеристика групп обследованных больных.

2.3. Методы исследования.

2.3.1 .Оценка эффекторной функции ТЬЯ.

Выделение МНК из периферической крови человека.

Культивирование МНК периферической крови человека.

2.3.2. Определение концентрации цитокинов в культуральных супернатантах методом иммуноферментного анализа.

2.3.3.Оценка экспрессии ТЬЯ на моноцитах периферической крови.

2.3.4.0ценка экспрессии мРНК ТЬЯ в МНК периферической крови.

2.3.4.1. Методы выделения РНК из МНК.

2.3.4.2.Проведение реакции обратной транскрипции.

2.3.4.3.Постановка ПЦР в реальном времени, метод ДДс1.

2.3.5. Статистическая обработка результатов.

Результаты и обсуждение

ГЛАВА III. Оценка эффекторной функциональной активности

ТЬЯ на МНК периферической крови человека.

3.1. Определение эффекторной функциональной активности ТЬЯ по выработке ФНОа.

3.2.Исследование влияния лигандов TLR на выработку ИФНа

МНК здоровых людей.

3.3 Оценка эффекторной функции TLR у здоровых людей разных возрастных групп.

ГЛАВА IV. Анализ системы TLR у больных первичными иммунодефицитами.

4.1.Оценка эффекторной функции TLR на МНК больных ПИД с дефектами антителообразования.

4.1.1. Определение спонтанной продукции ФНОа МНК периферической крови больных ОВИН и Х-АГГ.

4.1.2.Определение стимулированной лигандами TLR продукции ФНОа МНК больных ОВИН и Х-АГГ.

4.1.3.Исследование влияния лигандов То11-подобных рецепторов на выработку ИФНа МНК больных ПИД с дефектами антителообразования.

4.1.4.Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхности моноцитов периферической крови больных ПИД с дефектами антителообразования.

4.1.5.Оценка экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в МНК периферической крови больных ПИД с дефектами антителообразования.

4.2.0ценка показателей системы TLR в МНК периферической крови детей с нейтропенией.

4.2.1.Определение эффекторной функции TLR на МНК периферической крови больных нейтропенией.

4.2.2.Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на поверхности моноцитов периферической крови больных нейтропенией.

ГЛАВА V. Анализ системы TLR в МНК периферической крови больных при острых патологических состояниях, сопровождающихся деструкцией ткани.

5.1.Оценка компонентов системы TLR у больных острым инфарктом миокарда.

5.1.1.Оценка эффекторной функции TLR2 и TLR4 на МНК больных острым инфарктом миокарда.

5.1.2. Изучение влияния rHSP70 на функциональную активность

TLR4 на МНК здоровых доноров и больных ОИМ.

Исследование совместного действия лигандов TLR2 и TLR4 на выработку ФНО а МНК здоровых доноров in vitro.

5.1.3.Особенности TLR индуцированной выработки ФНОа МНК у отдельных больных ОИМ в динамике заболевания.

5.1.4.Анализ экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных острым инфарктом миокарда.

5.2,Оценка компонентов системы TLR в мононуклеарных клетках периферической крови больных острым деструктивным панкреатитом.

5.2.1.Оценка эффекторной функции TLR2 и TLR4 у больных

ОДП в динамике заболевания.

5.2.1.1.Определение спонтанной выработки провоспалительных цитокинов у больных ОДП

Изучение влияния препарата Лорноксикам на опосредованную TLR 1/2 и TLR 4 выработку провоспалительных цитокинов МНК здоровых доноров in vitro.

5.2.1.2,Определение спонтанной выработки провоспалительных цитокинов у больных, получающих Лорноксикам.

5.2.1.3.Определение индуцированной лигандами TLR2 и TLR4 выработки провоспалительных цитокинов МНК больных ОДП. 189 5.2.2.Оценка экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах больных ОДП в динамике заболевания.

5.2.3. Анализ экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в мононуклеарных клетках больных ОДП.

5.2.4.Изменения показателей в системе TLR у больных ОДП с развитием гнойно-деструктивных осложнений.

ГЛАВА VI. Заключение.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Клиническая иммунология, аллергология», 14.03.09 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплексный анализ системы Toll-подобных рецепторов при различных патологических состояниях человека»

Актуальность исследования. Изучение механизмов врожденного иммунитета в настоящее время является одной из актуальных проблем современной фундаментальной и клинической иммунологии. В 90-х годах XX столетия Ch. Janeway и R. Medzhitov выдвинули гипотезу о том, что врожденный иммунитет обладает определенной специфичностью к чужеродным антигенам. Ключевыми рецепторами врожденного иммунитета являются сигнальные паттерн распознающие рецепторы (ПРР) - Toll-подобные рецепторы (TLR) [31,279,280]. За последние 20 лет достигнуты впечатляющие успехи в изучении роли TLR во врожденном и адаптивном иммунитете, что позволило совершенно по-новому взглянуть на природу иммунных процессов в организме. TLR распознают высоко консервативные структуры патогенных микроорганизмов, так называемые паттерны, ассоциированные с микроорганизмами (pathogen-associated molecular patterns - РАМР). Различные макромолекулы служат микробными лигандами для TLR, включая липиды, углеводы, белки и нуклеиновые кислоты. К наиболее известным лигандам TLRs экзогенного происхождения относятся компоненты клеточной стенки бактерий: пептидогликаны (ПГ), липополисахариды (ЛПС); флагеллин, ДНК микроорганизмов, вирусная РНК и многие другие. В настоящее время показано, что лигандами для TLR могут также являться эндогенные молекулы, высвобождающиеся в результате некроза клеток и массивной деструкции тканей, а также распада молекул внеклеточного матрикса. Такие лиганды получили обозначение как «сигналы опасности» или DAMP (damage-associated molecular pattern). К эндогенным активаторам TLR относятся белки теплового шока - HSP60, HSP70, фибронектин, (3-дефензин и многие другие [380,120,168]. Распознавание экзогенных и эндогенных лигандов TLR инициирует активацию сигнальных путей, в результате чего происходит экспрессия генов цитокинов, костимуляторных молекул, противомикробных пептидов и других молекул. Продукты этих генов контролируют систему врожденного иммунитета и в дальнейшем направляют развитие адаптивного иммунного ответа [46,76,86,206,91,321,384,235]. Интенсивность ответа и его направленность в дальнейшем определяются несколькими компонентами, составляющими систему ТЫ1. Система ТЪЯ включает лиганды активирующие ТЫ1, сами рецепторы, молекулы, осуществляющие трансдукцию сигнала - адапторные белки, а также эффекторные молекулы, которые вырабатываются в результате активации ТЪЯ и опосредуют их дальнейшие эффекты [34]. Дефекты в системе ТЬЯ: нарушения распознавания лигандов, экспрессии ТЪЯ, трансдукции сигнала, выработки эффекторных молекул, а также полиморфизм генов ТЬЯ могут приводить к развитию тяжелых инфекций, аутоиммунных заболеваний, атеросклероза, аллергопатологии и других заболеваний [146,340,255,386,293]. Количество патологий с нарушениями в системе ТЪЯб растет.

Первичные иммунодефицита (ПИД) с дефектами антителообразования, такие как общая вариабельная иммунологическая недостаточность - ОВИН и Х-сцепленная агаммаглобулинемия - Х-АГГ характеризуются частыми реккурентными бактериальными инфекциями. Нарушения, выявляемые при ОВИН, вызваны множественными дефектами иммунной системы, и на данный момент нет единого мнения о молекулярных механизмах этих нарушений. В последнее время в литературе появляются данные о дефектах созревания антигенпрезентирующих клеток у больных ОВИН [111,148,409]. Изучение механизмов функционирования врожденной иммунной системы, оценка состояния компонентов системы ТЫ1 у больных ПИД с дефектами антителообразования позволит прояснить иммунопатогенез ОВИН, оценить вклад механизмов врожденного иммунитета в развитие и тяжесть течения инфекций и других осложнений.

Со времени открытия ТЬЯ представление о них как о структурах, участвующих только в противоинфекционной защите, существенно видоизменилось. При многих воспалительных заболеваниях, сопровождающихся массивной клеточной деструкцией таких, как инфаркт миокарда, острый панкреатит, происходит высвобождение большого количества эндогенных лигандов, что приводит к активации сигнальных путей TLR. Иногда высвобождаемые DAMP связывают с так называемым "стерильным воспалением", которое развивается в ответ на травму, ишемию, массивное тканевое повреждение при отсутствии патогенной инфекции и сопровождается высокой выработкой провоспалительных цитокинов. Чрезмерная активация TLR и выработка неконтролируемого количества провоспалительных цитокинов могут способствовать развитию системной воспалительной реакции, дальнейшему повреждению тканей, формированию осложнений основного заболевания [34]. Исследование системы TLR имеет важное значение в понимании патогенеза заболеваний, сопровождающихся деструкцией ткани.

Для выявления дефектов, связанных с нарушением функционирования системы TLR, необходимы надежные методы. Комплексное исследование системы TLR при различных заболеваниях позволит оценить роль механизмов врожденного иммунитета в развитии патологии. Выявление нарушений в системе То11-подобных рецепторов способствует проведению более точной своевременной диагностике, прогнозированию характера течения заболевания, дает возможность изучить патогенетические аспекты развития патологии, а также научно обосновать и разработать новые подходы адекватной терапии.

Цель исследования: разработать аналитический подход комплексной оценки. компонентов системы распознающих рецепторов врожденного иммунитета - То11-подобных рецепторов, основанный на определении эффекторной функциональной активности, экспрессии молекул TLR и уровня экспрессии мРНК TLR у здоровых людей, больных с иммунодефицитами и у больных при острых заболеваниях, сопровождающихся деструкцией ткани, оценить возможность использования выявленных изменений в качестве маркеров прогноза течения заболевания.

1 .Разработать комплексный подход к оценке системы То11-подобных рецепторов на уровне экспрессии генов, белков и секретируемых молекул, опосредующих эффекторную функциональную активность TLR на мононуклеарных клетках (МНК) периферической крови человека.

2.Разработать метод и провести оценку эффекторной функциональной активности TLR на МНК периферической крови in vitro у здоровых людей различных возрастных групп (взрослые здоровые доноры, дети 10-15 лет, дети 0,5-3 лет).

3.Провести анализ системы TLR у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования. Определить эффекторную функциональную активность TLR2 и TLR4, их экспрессию на поверхности моноцитов, а также уровень экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК периферической крови больных общей вариабельной иммунологической недостаточностью и Х-сцепленной агаммаглобулинемией.

4,Оценить значимость выявленных изменений уровня экспрессии и функционирования TLR в иммунопатогенезе и развитии клинических проявлений у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования.

5.С помощью разработанного подхода проанализировать состояние системы TLR на МНК периферической крови больных при острых патологических состояниях, сопровождающихся деструкцией ткани (острый инфаркт миокарда, острый деструктивный панкреатит) в динамике. 6.Определить диагностическую значимость и возможность использования выявленных изменений уровня экспрессии мРНК TLR, экспрессии молекул рецепторов на поверхности клеток и эффекторной функциональной активности TLR у больных острым инфарктом миокарда и острым деструктивным панкреатитом в качестве маркеров прогноза течения и исхода заболевания.

7.Обосновать возможность использования нестероидного противовоспалительного препарата Лорноксикам в комплексном лечении больных острым деструктивным панкреатитом на основе оценки системы тья.

Научная новизна работы

В работе впервые представлен аналитический подход к оценке системы То11-подобных рецепторов,) заключающийся в поэтапном исследовании и анализе эффекторной функциональной активности ТЪЯ, экспрессии молекул ТЬЯ и уровне экспрессии мРНК ТЪЯ МНК периферической крови человека.

Работа содержит новые данные о вовлечении механизмов врожденного иммунитета в иммунопатогенез первичных иммунодефицитов с дефектами антителообразования. Обнаружены нарушения в системе ТТЛ у больных ОВИН и Х-АГГ. Показано, что при данных ПИД снижена эффекторная функциональная активность ТЫ12 и ТЫ14 на МНК, определяемая по индуцированной лигандами выработке ФНОа, экспрессия этих рецепторов на поверхности моноцитов, нарушена экспрессия мРНК ТЬК2 и ТЫ14. У больных ОВИН выявлен дисбаланс ТЫ14-опосредованной выработки ФНОа и ИФНа МНК.

Впервые на основе нарушения функционирования системы ТЬЯ в динамике заболевания определены прогностические критерии развития неблагоприятного исхода острого инфаркта миокарда (ОИМ). Показано, что повышение эффекторной функциональной активности и экспрессии ТЬЯ2 и ТЬЯ4 на МНК у больных ОИМ в динамике заболевания может приводить к развитию осложнений.

Впервые проанализированы показатели системы ТЪЯ у больных острым деструктивным панкреатитом (ОДП) в динамике: эффекторная функциональная активность ТЫ12 и ТЬЯ4, экспрессия молекул на поверхности моноцитов и уровень экспрессии мРНК ТЫ12 и ТЫ14 в МНК. В работе представлены новые данные о вовлечении рецепторов врожденного иммунитета - TLR2 и TLR4 в развитие и течение ОДП. Установлено, что снижение экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 к концу 1-ой недели заболевания характерно для легкого течения, в то время как тяжелое течение ОДП сопровождается ростом уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 в эти сроки.

Впервые показано, что у больных ОДП изменения в системе TLR, характеризующиеся низкими значениями экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 на 1-й неделе заболевания в сочетании со сниженными значениями индуцированной выработки провоспалительных цитокинов, могут приводить к развитию гнойно-деструктивных осложнений.

Установлено, что нестероидный противовоспалительный препарат Лорноксикам приводит к снижению индуцированной лигандами TLR2 и TLR4 выработки провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-6, ИЛ-8) МНК периферической крови здоровых доноров в культуре in vitro.

Впервые установлено, что применение Лорноксикама в комплексном лечении больных ОДП на ранних сроках заболевания приводит к снижению TLR2 и Т1^4-опосредованной выработки провоспалительных цитокинов, уровня экспрессии мРНК TLR2 и TLR4 МНК у этих больных.

Практическая значимость работы

В данной работе разработан метод для оценки эффекторной функциональной активности TLR, основанный на определении индуцированной соответствующими лигандами TLR выработки провоспалительного цитокина - ФНОа и ИФНа МНК периферической крови человека. Проведена оценка выработки ФНОа и ИФНа МНК в ответ на лиганды TLR у здоровых людей различных возрастных групп. Предложенный метод позволяет оценить эффекторную функциональную активность рецепторов врожденного иммунитета у здоровых людей и больных с иммунопатологией.

У больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) в ходе настоящего исследования обнаружены нарушения в системе рецепторов ТЬЯ на МНК. Выявленные нарушения экспрессии и функционирования ТЪЫ2 и ТЪБМ у больных ОВИН свидетельствуют о новых молекулярных дефектах в системе врожденного иммунитета, и позволяют уточнить иммунопатогенез ОВИН.

С использованием разработанного подхода выявлены новые маркеры развития осложнений у больных острым инфарктом миокарда. Показано, что увеличение ТЬИ2 и ТЬЯ4-опосредованной выработки ФНОа и экспрессии молекул ТЫ12 и ТЫ14 на моноцитах больных к 14-м суткам заболевания может служить прогностическим критерием развития осложнений ОИМ.

Предложены новые маркеры ранней диагностики неблагоприятного исхода острого деструктивного панкреатита, основанные на определении низких значений экспрессии мРНК ТЪЯ2 и ТЪЯ4, сопровождающихся угнетением индуцированной лигандами ТЫ12 и ТЬЯ4 выработки ФНОа и высоких значений ИЛ-6 в сыворотке крови больных в 1-е сутки заболевания.

Обосновано применение нестероидного противовоспалительного препарата - Лорноксикам в комплексном лечении больных острым деструктивным панкреатитом на ранних сроках заболевания. Лорноксикам приводит к снижению ТЬЯ2 и ТЬЯ4-опосредованной выработки провоспалительных цитокинов, уровня экспрессии мРНК ТЪЯ2 и ТЬЯ4 МНК у больных на 3-й сутки заболевания и позволяет снизить риск развития системной воспалительной реакции.

Предложенный комплексный подход к оценке системы ТЫ1 открывает новые направления в раннем прогнозе течения, исхода заболевания и возможности проведения целенаправленной патогенетической коррекции.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан аналитический подход комплексной оценки системы рецепторов врожденного иммунитета - То11-подобных рецепторов, основанный на определении эффекторной функциональной активности ТЬЯ, экспрессии молекул и уровня экспрессии мРНК ТЬЯ мононуклеарными клетками периферической крови человека.

2. Использование разработанного подхода позволило выявить нарушения в системе врожденного иммунитета у больных первичными иммунодефицитами с дефектами антителообразования (ОВИН и Х-АГГ) на уровне функционирования и экспрессии ТЫ12, ТЫ14 мононуклеарными клетками периферической крови.

3. Комплексное исследование системы ТЬЯ при патологических состояниях, сопровождающихся деструкцией ткани (острый инфаркт миокарда, острый деструктивный панкреатит), позволило выявить активацию системы ТЬЯ на ранних сроках заболевания. Увеличение в динамике заболевания значений эффекторной функциональной активности, экспрессии молекул ТЪЯ2 и ТЫ14 и/или экспрессии мРНК ТЬЯ2 и ТЬЯ4 в мононуклеарных клетках периферической крови может служить критерием тяжести течения и развития осложнений при острых заболеваниях, сопровождающихся деструкцией ткани.

4. Использование нестероидного противовоспалительного препарата Лорноксикам в лечении больных острым деструктивным панкреатитом на ранних сроках заболевания приводит к снижению ТЬК2- и ТЬЯ4-опосредованной выработки провоспалительных цитокинов и экспрессии мРНК ТЬИ2 и ТЬЯ4 в мононуклеарных клетках периферической крови больных, позволяет снизить риск развития системной воспалительной реакции.

Внедрение результатов работы

Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры иммунологии Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России для студентов, аспирантов и ординаторов, используются в практической работе хирургических отделений ГКБ №55 г.Москвы.

Апробация результатов диссертационной работы

Материалы диссертационной работы докладывались на научных заседаниях кафедры иммунологии и отдела иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития России, в 2006 году на II Всероссийском конгрессе по детской аллергологии и иммунологии, в 2007 году на VI Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», в 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011 и 2012 году в Москве на XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», на Объединенном иммунологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008), Европейском конгрессе педиатров (Москва, 2009), III Всероссийском Конгрессе по детской аллергологии и иммунологии (Москва 2009г.), IX Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2010 г.), XVIII международный Конгресс Хирургов - гепатологов стран СНГ «Актуальные проблемы Хирургической гепатологии» (Москва, 2011г.), XI Международный конгресс «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011г.).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 292 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 422 источника, из которых 87 отечественных и 335 зарубежных. Работа содержит 46 таблиц и 52 рисунка. Публикации